細胞凋亡檢測是生物學研究中一項重要的技術，廣泛應用于疾病機理研究、藥物篩選等領域。今天，我們就來詳細介紹如何使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒進行細胞凋亡檢測。
實驗原理
在細胞凋亡早期階段，細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）從胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞外，暴露在細胞外環(huán)境中，細胞膜通透性增加，從而被PS特異的Annexin-V探針標記。
Annexin-V為Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對PS有極強的結(jié)合力。PI是一種經(jīng)濟、穩(wěn)定的核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。
將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI被排除在活細胞和早期凋亡細胞之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性。
實驗材料準備
Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒
細胞樣本（懸浮細胞或貼壁細胞）
離心機
PBS
熒光顯微鏡或流式細胞儀
實驗方法
1. 細胞收集
懸浮細胞：1000 g 離心 5 min，棄去上清。加入 1 mL 預冷的 PBS 輕輕重懸細胞沉淀，1000 g 離心 5 min，棄去上清，保留細胞沉淀。
貼壁細胞：小心吸取細胞培養(yǎng)液保存?zhèn)溆?。加?PBS 洗滌后，加入適量胰酶消化液（盡量不含 EDTA，以免影響 Annexin V 和 PS 的結(jié)合）消化細胞。加入前面收集的培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞，制成單細胞懸液，1000 g 離心 5 min，棄去上清。加入 1 mL 預冷的 PBS 輕輕重懸細胞沉淀，1000 g 離心 5 min，棄去上清，保留細胞沉淀。 注：建議胰酶消化液不含 EDTA。
2. 重懸細胞
加入 195 μL Binding Buffer，輕輕重懸細胞，使其重懸至適宜濃度。
3. 加入染料
①加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。 Annexin V-FITC 用于檢測早期凋亡細胞（磷脂酰絲氨酸外翻）。
②加入 10 μL PI Stain，輕輕混勻。 PI 用于檢測晚期凋亡細胞或壞死細胞（DNA 染色）。
4. 孵育
室溫下避光孵育 10-20 min，使染料與細胞充分結(jié)合。
檢測與分析
流式細胞儀檢測
1. 設置合適的通道檢測 Annexin V-FITC 和 PI 的熒光信號。
2. 三組對照的設置非常重要，可以幫助校正背景信號和確定凋亡細胞的比例。
未染色組：用于檢測自然熒光。
PI 單染組：用于確定 PI 的陽性閾值。
Annexin V-FITC 單染組：用于確定 Annexin V 的陽性閾值。
熒光顯微鏡檢測
1. 離心后用少量 Binding Buffer 重懸細胞，涂片。
2. 在熒光顯微鏡下觀察，通常 Annexin V-FITC 發(fā)出綠色熒光，PI 發(fā)出紅色熒光。
3. 可以通過拍照或計數(shù)來定量分析凋亡細胞的比例。
注意事項
1. 整個操作過程中應盡量保持低溫，以減少細胞代謝和染色過程中的自發(fā)熒光。
2. 避免長時間暴露于光線下，特別是 FITC 類染料，因為光照會導致熒光淬滅。
3. 根據(jù)實驗需求調(diào)整細胞數(shù)量和染料濃度。
4. 如果使用流式細胞儀，確保儀器已校準并且通道設置正確。
結(jié)果解讀
左上象限QI：通常為雜質(zhì)或技術誤差造成的假陽性。
右上象限Q2：晚期凋亡或壞死細胞，Annexin v和PI雙陽性細胞。
右下象限Q3：早期凋亡細胞，由 Annexin ∨ 標記的單陽性細胞。
左下象限Q4：活細胞，未發(fā)生凋亡的細胞。
細胞凋亡率：Q2與Q3象限百分率的和。
